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Reprod. Nutr. Dev.
Volume 40, Number 6, November-December 2000
Page(s) 559 - 569
DOI: 10.1051/rnd:2000137

Reprod. Nutr. Dev. 40 (2000) 559-569

Evidence that growth factors IGF-I, IGF-II and EGF can stimulate nuclear maturation of porcine oocytes via intracellular protein kinase A

Alexander V. Sirotkina - Janka Dukesováa,b - Alexander V. Makarevicha - Aloiz Kubekb - Jozef Bullaa

aResearch Institute of Animal Production, 949 92 Nitra, Slovak Republic
bState University of Agriculture, 949 01 Nitra, Slovak Republic

(Received 7 February 2000; accepted 23 November 2000)


The aim of our in vitro experiments was to study the role of growth factors and protein kinase A (PKA)-dependent intracellular mechanisms in the control of nuclear maturation of porcine oocytes. Oocytes were cultured with or without growth factors (IGF-I, IGF-II, EGF; 10 ng$\cdot$mL-1 medium) and inhibitors of PKA (Rp-cAMPS or KT5720; 100 ng$\cdot$mL-1). Stages of meiosis were determined from the structure of chromosomes after staining with Giemza. Intracellular levels of PKA were evaluated immunocytochemically using primary antisera against the PKA regulatory and catalytic subunits and by Western immunoblotting using primary antiserum against the PKA catalytic subunit. It was found that after 24 h culture the majority of oocytes had resumed nuclear maturation (they were at a stage of meiosis after diplotene) and that after 48 h culture the majority of cells had completed maturation (they had reached metaphase II of meiosis). Addition of IGF-I, IGF-II or EGF, or a combination of IGF-I and EGF, significantly increased the proportion of oocytes which resumed and completed meiosis. Immunocytochemistry demonstrated a significant increase in the proportion of cells containing catalytic and, in some cases, the regulatory subunits of PKA after addition of IGF-I, IGF-II and EGF. Immunoblotting showed the presence of 2 forms of the PKA catalytic subunit within the oocytes (MW approximately 52 and 40 kD). EGF, but not IGF-I or IGF-II, increased the content of both isoforms. Inhibitors of PKA, when given alone, did not substantially influence the proportion of oocytes which resumed or completed meiosis. However, Rp-cAMPS and KT5720 both prevented the stimulatory effects of IGF-I, IGF-II and EGF on the resumption and completion of oocyte maturation. The present observations suggest (1) that IGF-I, IGF-II and EGF are potent stimulators of both resumption and completion of porcine oocyte nuclear maturation, (2) that PKA is present in oocytes, and (3) that PKA-dependent intracellular mechanisms can mediate the action of growth factors on porcine oocytes.

Keywords: insulin-like growth factor / epidermal growth factor / protein kinase A / meiosis


Les facteurs de croissance IGF-I, IGF-II et EGF peuvent stimuler la maturation nucléaire de l'ovocyte de porc par la voie intracellulaire de la protéine kinase A. Ces expériences ont pour but d'étudier in vitro le rôle des facteurs de croissance et des mécanismes intracellulaires dépendant de la protéine kinase A (PKA) vis-à-vis du contrôle nucléaire des ovocytes porcins. Des ovocytes ont été cultivés avec ou sans facteurs de croissance (IGF-I, IGF-II, EGF ; 10 ng$\cdot$mL-1 de milieu) et avec ou sans des inhibiteurs de la PKA (Rp-cAMPS, KT5720 ; 100 ng$\cdot$mL-1). Les stades de la méiose ont été déterminés par examen des chromosomes après coloration par le Giemza. Les niveaux intracellulaires de PKA ont été évalués par immunocytochimie en utilisant un anticorps primaire de la sous-unité régulatrice et de la sous-unité catalytique de PKA et par Western immunoblot avec des anticorps primaires dirigé contre la sous-unité catalytique. Après 24 h de culture, la majorité des ovocytes a repris sa maturation nucléaire (stade diplotène dépassé) et elle l'a terminée (stade métaphase II atteint) après 48 h. L'addition de IGF-I, IGF-II ou d'EGF, ou une combinaison de IGF-I et d'EGF, accroît significativement la proportion d'ovocytes qui ont repris et terminé leur méiose. L'addition de IGF-I, IGF-II ou d'EGF s'accompagne d'un accroissement significatif des cellules exprimant la sous-unité catalytique et dans certains cas la sous-unité régulatrice de la PKA (immunocytochimie). La présence de deux formes de la sous-unité catalytique à l'intérieur des ovocytes est montrée en immunoblot (PM 52 et 40 kD environ). EGF mais non IGF-I ou IGF-II augmente le contenu des deux isoformes. Les inhibiteurs de la PKA, utilisés seuls, ne modifient pas la proportion des ovocytes qui reprennent ou terminent leur méiose. Cependant ils préviennent les effets stimulants de IGF-I, IGF-II et EGF. Ces observations suggèrent que : (1) IGF-I, IGF-II et EGF sont des stimulateurs efficaces de la reprise et de l'achèvement de la maturation nucléaire chez le porc, (2) PKA est présente dans les ovocytes, et (3) les facteurs de croissance peuvent agir sur les ovocytes porcins par des mécanismes intracellulaires dépendant de la PKA.

Mots clé : IGF-I / IGF-II / EGF / protéine kinase A / méiose / porc

Correspondence and reprints: Alexander V. Sirotkin

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