Reprod. Nutr. Dev. 42 (2002) 35-43
DOI: 10.1051/rnd:2002004

Effect of growth factors on proliferation, apoptosis and protein kinase A expression in cultured porcine cumulus oophorus cells

Alexander V. Sirotkin^a, Janka Dukesová^b, Juraj Pivko^a, Alexander V. Makarevich^a and Alojz Kúbek<sup>b

a</sup>  Research Institute of Animal Production, 949 92 Nitra, Slovak Republic
^b  State University of Agriculture, 949 01 Nitra, Slovak Republic

(Received 23 April 2001; accepted 16 January 2002)

Abstract
The proliferation, apoptosis and protein kinase A (PKA) in porcine cumulus oophorus (CO) before and after 40 h of culture together with oocytes in the presence of IGF-I, IGF-II and EGF (all at 10 ng.mL ^-1 medium) were compared. Cellular proliferation, apoptosis and PKA contents were evaluated by immunocytochemistry using specific antibodies against PCNA, TUNEL and catalytic (C-alpha) and regulatory (RI) subunits of PKA. The in-vitro culture of oocyte-CO complexes in a basal medium was accompanied by a decrease in the proportion of PCNA-positive CO cells (from 51 to 36%, p < 0.05). The addition of either IGF-I or EGF to the culture medium prevented this process and increased the proliferation rate (64 and 67% respectively, p < 0.001). During culture, the percentage of apoptotic (TUNEL-positive) CO cells increased from 42 to 57% ( p < 0.01). The addition of IGF-I or EGF resulted in the inhibition of apoptosis to 36 and 12% respectively ( p < 0.001). IGF-II and EGF reduced the amount of PKA catalytic subunits in the CO (percentage of cells with immunoreactive PKA catalytic subunits (28%, p < 0.05 and 27%, p < 0.05 respectively; versus control -41%), whilst the effect of IGF-I on this index was insignificant (31%). The expression of the PKA regulatory subunit was increased by EGF (51% compared with 29% in the control, p < 0.05), but not by IGF-I or IGF-II (30 and 29%).Our observations demonstrate that 40 h of culture of porcine CO resulted in a decrease in the proliferation and development of apoptosis in CO cells. IGF-I or EGF can stimulate proliferation and inhibit apoptosis. The influence of growth factors on the PKA content of the CO suggests that cAMP/PKA may be a mediator of the action of growth factors on these cells. The differential effects of IGFs and EGF on the regulatory subunit of PKA may indicate differences between their mechanisms of action.

Résumé
Effets des facteurs de croissance sur la prolifération, l'apoptose et l'expression de la protéine kinase A des complexes " cumulus-ovocyte " de porc en culture. Des complexes " cumulus-ovocyte " de porc (COC) ont été mis en culture en présence d'IGF-I, IGF-II, EGF (10 ng.mL ^-1 de milieu). Leurs effets sur la prolifération cellulaire, l'apoptose et la protéine kinase A (PKA) ont été évalués par immuno-cytochimie à l'aide d'anticorps spécifiques dirigés contre PCNA, TUNEL et les sous-unités catalytique (C-alpha) et régulatrice (RI) de PKA. En milieu témoin, les cellules des COC montrent une diminution de prolifération (de 51 à 31 % de cellules PCNA positives, p < 0,05). Avec IGF-I ou EGF dans le milieu, on constate au contraire une augmentation de la prolifération par comparaison aux niveaux de départ (64 et 67 % respectivement, p < 0,001). Pendant la culture, les cellules apoptotiques (TUNEL-positives) ont augmenté de 42 à 57 % ( p < 0,01) ce qui est inhibé par l'addition d'IGF-I ou d'EGF (36 et 12 % des témoins respectivement, p < 0,001). IGF-II et EGF ont réduit de façon significative les quantités de la sous-unité catalytique de PKA (cellules immuno-détectables pour cette sous-unité : 28 et 27 % respectivement par comparaison aux témoins : 41 %, p < 0,05) alors que l'effet d'IGF-I n'a pas été significatif (31 %). EGF a provoqué une augmentation de la sous-unité régulatrice de PKA (51 % versus 29 % chez les témoins, p < 0,05) alors que IGF-I et IGF-II ont été sans effet sur cette dernière (30 et 29 % respectivement). Nos observations montrent que les cellules de COC de porc ont une activité de prolifération en diminution et une apoptose en augmentation lorsqu'elles sont cultivées pendant 40 h. IGF-I et EGF peuvent stimuler la prolifération et inhiber l'apoptose. L'influence de ces facteurs de croissance sur PKA suggère que cAMP/PKA peut être un médiateur de ces facteurs sur ces types cellulaires. Les effets différenciés des IGFs et de l'EGF sur les sous-unités de PKA peuvent indiquer des différences de leurs modes d'action.

Key words: insulin-like growth factor I / insulin-like growth factor II / epidermal growth factor / cumulus oophorus / proliferation / apoptosis / protein kinase A

Mots clés : IGF-I / IGF-II / EGF / cumulus oophorus / prolifération / apoptose / protéine kinase A

Correspondence and reprints: Alexander V. Sirotkin sirotkin@vuzv.sk

© INRA, EDP Sciences 2002