Free Access
| Issue |
Reprod. Nutr. Dev.
Volume 40, Number 3, May-June 2000
|
|
|---|---|---|
| Page(s) | 305 - 319 | |
| DOI | https://doi.org/10.1051/rnd:2000127 | |
DOI: 10.1051/rnd:2000127
Reprod. Nutr. Dev. 40 (2000) 305-319
Culture of porcine spermatogonia: effects of purification of the germ cells, extracellular matrix and fetal calf serum on their survival and multiplication
Cécile Marret - Philippe Durand
INSERM/INRA U 418, Hôpital Debrousse, 29 rue S
ur Bouvier, 69322 Lyon Cedex 05, France
(
Abstract:
Initial studies to establish an in vitro system allowing survival and multiplication of porcine
spermatogonia are described. Purified spermatogonia from 3-week-old pigs were cultured for 9 days alone or
in the presence of Sertoli cells in either control medium or in medium supplemented with 5% fetal calf
serum (FCS). Under either condition the number and the viability of the cells decreased with time, but
both parameters were positively influenced by the presence of FCS. However, very few, if any,
spermatogonia were able to take up BrdU under either condition. In another series of experiments, small
fragments of seminiferous tubules from 3-week-old pigs were cultured in the presence of FCS, or seeded on
an extracellular matrix. Under these conditions the number of cells decreased between day 0 and day 2 or
day 5, then it remained roughly constant until the end of the culture. The number of spermatogonia
decreased 2.5 fold during the two-week culture period. Spermatogonia were able to incorporate BrdU until
the end of the experiment. The number of BrdU-labeled spermatogonia was higher when tubule-segments were
seeded on an extracellular matrix. Then, the effects of the association of FCS and extracellular matrix
were tested. The number of spermatogonia, during the whole culture period, was higher in serum-containing
cultures than in serum-free cultures. As for the number of spermatogonia able to incorporate BrdU at
different days, is decreased 3 fold between day 2 and 14 irrespective of the culture conditions. By
contrast, the number of spermatogonia, labeled with BrdU between day 1 and 2, measured on days 5 to 14 of
culture, was higher in serum-containing cultures. Finally, the number of spermatogonia labeled between day
1 and 2 was higher from day 5 onward than the number of spermatogonia able to take up BrdU between days 4
and 13. Taken together, these results indicate that intercellular communication and extracellular matrix
are important for spermatogonia multiplication and that FCS promotes the survival of spermatogonia under
in vitro conditions.
Keywords:
spermatogenesis / stem cells / in vitro
Résumé:
Culture des spermatogonies porcines : effets de la purification des cellules
germinales, d'une matrice extracellulaire et du sérum de veau ftal sur leur survie et leur
multiplication. Cet article présente les premières études réalisées pour mettre en place un système de
culture permettant la survie et la multiplication des spermatogonies de porc. Des spermatogonies
purifiées, issues de porcelets âgés de 3 semaines ont été cultivées pendant 9 jours, soit seules, soit en
présence de cellules de Sertoli, dans un milieu chimiquement défini, additionné ou non de 5 % de sérum de
veau ftal (SVF). Dans ces deux conditions, le nombre et la viabilité des cellules diminuent au cours
de la culture, mais ces deux paramètres sont positivement influencés par la présence de SVF ; par contre,
aucune spermatogonie n'est capable d'incorporer du BrdU. Dans une autre série d'expériences, de petits
fragments de tubes séminifères de porcelets de 3 semaines ont été cultivés en présence de SVF ou sur une
matrice extracellulaire. Le nombre de cellules décroît entre les jours 0 et 2 ou 5 puis reste constant
jusqu'à la fin de l'expérience. Le nombre de spermatogonies diminue 2,5 fois au cours des deux semaines de
culture quelles que soient les conditions de celle-ci. Par contre des spermatogonies sont, dans ces
conditions, capables d'incorporer du BrdU à tous les jours de la culture ; le nombre de celles-ci est plus
grand lorsque la culture est réalisée sur une matrice extracellulaire. Les effets de l'association d'une
matrice et du SVF ont alors été recherchés. Tout au long de la culture, le nombre de spermatogonies est
plus élevé en présence de sérum ; quant au nombre de spermatogonies capables d'incorporer du BrdU, il
diminue de 3 fois entre les jours 2 et 14, que le milieu contienne du SVF ou non. Par contre, le nombre de
spermatogonies ayant incorporé du BrdU entre les jours 1 et 2, mesuré aux jours 5 à 14 de la culture est
plus élevé en présence qu'en absence de sérum. Enfin, le nombre de spermatogonies marquées entre les jours
1 et 2, mesuré à partir du jour 5, est plus élevé que celui des spermatogonies capables d'incorporer le
BrdU aux jours 4 à 13 de la culture. Ces résultats indiquent que des contacts intercellulaires étroits et
qu'une matrice extracellulaire sont des paramètres importants pour la multiplication des spermatogonies,
et que le SVF permet une meilleure survie des spermatogonies en culture.
tal sur leur survie et leur
multiplication. Cet article présente les premières études réalisées pour mettre en place un système de
culture permettant la survie et la multiplication des spermatogonies de porc. Des spermatogonies
purifiées, issues de porcelets âgés de 3 semaines ont été cultivées pendant 9 jours, soit seules, soit en
présence de cellules de Sertoli, dans un milieu chimiquement défini, additionné ou non de 5 % de sérum de
veau ftal (SVF). Dans ces deux conditions, le nombre et la viabilité des cellules diminuent au cours
de la culture, mais ces deux paramètres sont positivement influencés par la présence de SVF ; par contre,
aucune spermatogonie n'est capable d'incorporer du BrdU. Dans une autre série d'expériences, de petits
fragments de tubes séminifères de porcelets de 3 semaines ont été cultivés en présence de SVF ou sur une
matrice extracellulaire. Le nombre de cellules décroît entre les jours 0 et 2 ou 5 puis reste constant
jusqu'à la fin de l'expérience. Le nombre de spermatogonies diminue 2,5 fois au cours des deux semaines de
culture quelles que soient les conditions de celle-ci. Par contre des spermatogonies sont, dans ces
conditions, capables d'incorporer du BrdU à tous les jours de la culture ; le nombre de celles-ci est plus
grand lorsque la culture est réalisée sur une matrice extracellulaire. Les effets de l'association d'une
matrice et du SVF ont alors été recherchés. Tout au long de la culture, le nombre de spermatogonies est
plus élevé en présence de sérum ; quant au nombre de spermatogonies capables d'incorporer du BrdU, il
diminue de 3 fois entre les jours 2 et 14, que le milieu contienne du SVF ou non. Par contre, le nombre de
spermatogonies ayant incorporé du BrdU entre les jours 1 et 2, mesuré aux jours 5 à 14 de la culture est
plus élevé en présence qu'en absence de sérum. Enfin, le nombre de spermatogonies marquées entre les jours
1 et 2, mesuré à partir du jour 5, est plus élevé que celui des spermatogonies capables d'incorporer le
BrdU aux jours 4 à 13 de la culture. Ces résultats indiquent que des contacts intercellulaires étroits et
qu'une matrice extracellulaire sont des paramètres importants pour la multiplication des spermatogonies,
et que le SVF permet une meilleure survie des spermatogonies en culture.
Mots clé :
spermatogenèse / souches / in vitro
Correspondence and reprints: Philippe Durand
e-mail: durand@lyon151.inserm.fr
Copyright INRA, EDP Sciences